DNA连接酶既不作用在氢键,也不作用在磷酸二酯键.它是催化一段DNA末端的核苷酸上游离的羟基,与另一段DNA末端核苷酸上的游离磷酸基酯化形成磷酸二酯键的酶.也就是说,部分磷酸二酯键是在DNA连接酶的催化下形成的,而不能说DNA连接酶作用于磷酸二酯键。

DNA聚合酶也不作用于氢键，它与DNA连接酶都是生成磷酸二酯键；而限制酶（限制性核酸内切酶）是破坏磷酸二酯键。作用于氢键的一般考虑DNA解旋酶。