底物水平磷酸化（substrate level phosphorylation）：物质在生物氧化过程中，常生成一些含有高能键的化合物，而这些化合物可直接偶联ATP或GTP的合成，这种产生ATP等高能分子的方式称为底物水平磷酸化。

如甘油酸-2-磷酸脱水生成烯醇丙酮酸磷酸时，也能在分子内部形成一个高能磷酸基团，然后再转移到ADP生成ATP。又如在三羧酸循环中，琥珀酰CoA（辅酶A）生成琥珀酸，同时伴有GTP的生成，也是底物水平磷酸化。