合成的单链eDNA3’端能够形成一短的发夹结构，这就为第二链的合成提供了现成的引物。

利用第一链在反转录酶作用下产生的DNA RNA杂交链不用碱变性，而是在dNTP存在下。利用RNA酶H在杂交链的mRNA链上造成切口和缺口。从而产生一系列RNA引物，使之成为合成第二链的引物。cDNA是指互补(有时称拷贝)DNA。特指在体外经过逆转录后与RNA互补的DNA链。与平常我们所称谓的基因组DNA不同，cDNA没有内含子而只有外显子的序列。真核生物的mRNA或其他RNA的cDNA，在遗传工程方面广为应用。