革兰氏染色法的步骤包含涂片、干燥、固定、初染、水洗、媒染、水洗、脱色、复染、水洗、干燥观察共11步，应注意把握涂片的薄厚、加热温度，脱色时间及各染液质量。

1.涂片：在灭菌后的载玻片中央滴一滴待检样品，用烧红冷却后的接种环将液体铺匀。

2.干燥：载玻片置于酒精灯上加热至水分蒸发。

3.固定：载玻片在酒精灯火焰上快速过2~3次，用2~3秒后待冷却。

4.初染：滴加1~2滴草酸氨结晶紫染液，染色时间约一分钟。

5.水洗：用小水流冲洗载玻片，冲洗至水呈无色。

6.媒染：滴适量革兰氏染液，染色时间约一分钟。

7.水洗：同步骤5。8.脱色：在载玻片上滴加95％乙醇，至流下乙醇不呈紫色，大约用时半分钟后水洗。9.复染：滴加1~2滴沙黄染液，染色时间约一分钟。10.水洗：同步骤5。11.干燥、观察：待标本片干燥后观察，紫色为革兰氏阳性菌，红色为革兰氏阴性菌。应注意涂片时应薄而均匀，不宜过大；干燥时勿紧靠火焰，控制加热时间，防止标本烤枯；固定时，加热温度不可过高；脱色的时间应该根据标本的种类及涂片的薄厚程度进行适当调整，不可机械性的按照统一时间操作；应定期检查使用的染液质量，以免发生误差。