限制酶只能识别特定的核苷酸的碱基序列，在特定的位点进行切割，体现它的特异性。

限制性核酸内切酶（ restriction endonucleases ），根据结构和功能特性，把限制酶分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和IV型。Ⅰ型限制酶的切点不固定，很难形成稳定的、特异性切割末端；Ⅲ型限制酶对 DNA 链的识别序列是非对称的，不产生特异性的 DNA 片段，故基因工程实验中基本不用Ⅰ型和Ⅲ型限制酶。Ⅱ型限制酶的主要作用是切割 DNA 分子，在 DNA 重组、构建新质粒、建立 DNA 的限制性酶切图谱、 DNA 的分子杂交、制备 DNA 的放射性探针、构建基因文库等方面起到重要作用，是基因工程重要的工具酶。