的方法如下：打开Primer Premier5.0在线网页进行设计引物。

输入序列（目的基因的CDS的核酸序列）。进行产物长度、引物大小等的设定。点击pick primers后得到结果。利用DNAMAN检测引物是否存在发卡结构。打开DNAMAN软件，点击primer-Load primer-From Input，输入Forward引物；点击Primer-Two Primer Complementarity-Second primer From Input，即可查看引物能否形成发卡结构。检测结果（一般选择少于四个发卡结构的引物）。满足条件的即可确定为比较好的qPCR引物，发送至公司邮箱合成即可。